RNA pulldown
- RNA結(jié)合蛋白質(zhì)
- 高靈敏度
- 高度特異性
- 可定量分析
服務(wù)特色
金開瑞現(xiàn)提供RNA pull down檢測(cè)技術(shù)服務(wù)，使用特異性二抗進(jìn)行檢測(cè)，能有效避免抗體重鏈對(duì)結(jié)果的信號(hào)干擾。并且金開瑞配套自己的質(zhì)譜平臺(tái)，能顯著提升檢測(cè)效果。
服務(wù)介紹
蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。若待檢測(cè)目的蛋白明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)
- 高特異性：富集與特定RNA序列相互作用的蛋白質(zhì)，具有高度的特異性
- 高靈敏度：能夠檢測(cè)低豐度的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，提供高靈敏度的檢測(cè)能力
- 廣泛適用性：可用于研究各種RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄因子、RNA結(jié)合蛋白和翻譯調(diào)控因子等
- 可定量分析：通過引入外源標(biāo)記或熒光標(biāo)記的RNA探針，可以定量測(cè)量RNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度
- 聯(lián)合應(yīng)用：可與其他技術(shù)相結(jié)合，如質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)方法和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法等，進(jìn)一步深入研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
服務(wù)流程
客戶提供
RNA序列或者RNA序列構(gòu)建的質(zhì)粒（種屬）
相同種屬的細(xì)胞樣品
最終交付
- 基因合成測(cè)序報(bào)告；
- 構(gòu)建含目的基因的質(zhì)粒、菌液，測(cè)序報(bào)告；
- 體外轉(zhuǎn)錄模版的sense&antisense引物、模版電泳圖；
- RNA Pull down蛋白SDS-PAGE銀染；
- 質(zhì)譜鑒定報(bào)告。
服務(wù)說明
| 服務(wù)名稱 | 服務(wù)內(nèi)容 | 交付內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn) | 服務(wù)周期(工作日) |
| RNA pull-down （體外轉(zhuǎn)錄法） |
基因合成 |
測(cè)序報(bào)告 | 具體評(píng)估 |
| 體外轉(zhuǎn)錄sense和antisense模板擴(kuò)增 | 體外轉(zhuǎn)錄2次 | 20 | |
| sense和antisense體外轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記為探針 | 探針標(biāo)記2次(sense、antisense各1次) | ||
| RNA pull-down富集 | 2次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個(gè)泳道 | 4 | |
| 質(zhì)譜鑒定互作蛋白 | 質(zhì)譜鑒定sense、antisense | 10-15 | |
| RNA pull-down （探針法拉蛋白） |
QPCR檢測(cè)本 底表達(dá) 探針設(shè)計(jì)及合成 (包含對(duì)照) |
樣本和內(nèi)參各1次 circRNA探針-biotin/lncRNA探針-biotin/普通對(duì)照探針 |
24 |
| RNA探針富集效果檢測(cè) | 實(shí)驗(yàn)探針和對(duì)照探針各1次 | ||
| RNA pull-down富集 | 實(shí)驗(yàn)探針和對(duì)照探針各1次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個(gè)泳道 | 4 | |
| 質(zhì)譜鑒定互作蛋白 | 質(zhì)譜鑒定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各1次 | 10-15 | |
| RNA pull-down (探針法拉miRNA) |
QPCR檢測(cè)本 |
樣本和內(nèi)參各1次 | 28 |
| 底表達(dá) | |||
| 探針設(shè)計(jì)及合成 | circRNA探針-biotin/lncRNA探針-biotin/對(duì)照探針 | ||
| RNA探針富集效果檢測(cè) | 實(shí)驗(yàn)探針和對(duì)照探針各1次 | ||
| RNA pull-down富集 互作的蛋白/miRNA | 實(shí)驗(yàn)探針和對(duì)照探針各1次 | ||
| RNA和miRNA/lncRNA 逆轉(zhuǎn)錄及檢測(cè) | QPCR檢測(cè)(input、探針組、對(duì)照組) |
案例展示
在線課堂
常見問題與解析 (Q&A)
RNA pull down使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。 蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。若待檢測(cè)目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
LncRNA的富集大致上有三種方法: (1)探針法：針對(duì)該LncRNA的序列，設(shè)計(jì)生物素標(biāo)記的探針。此種方法最關(guān)鍵的是探針的特異性，所以最好用Northern Blot檢測(cè)探針的特異性。 可以結(jié)合內(nèi)源的LncRNA是探針法的最大優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)就是比較貴，需要的樣品量大。 (2)生物素標(biāo)記法：在LncRNA的5‘端加上T7啟動(dòng)子，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，可以制備大量的LncRNA。再通過生物素標(biāo)記試劑盒，就能得到大量的生物素標(biāo)記的LncRNA。常用的折疊的方法退火，從95℃退火到4℃，大約30秒一度就可以了。 (3)TRSA法：除了生物素，鏈霉親和素還可以識(shí)別TRSA結(jié)構(gòu)，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不錯(cuò)的選擇。
可以，前提是circRNA在細(xì)胞中表達(dá)豐度要高。
有，探針法和生物素標(biāo)記法的對(duì)照都是相應(yīng)的反義序列：探針的反義序列以及長(zhǎng)非編碼RNA的反義序列。TRSA法的對(duì)照是TRSA序列本身。
相關(guān)技術(shù)服務(wù)
| ? 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) | ? 酵母雙雜交 | ? 酵母單雜交 |
| ? DNA pull-down | ? EMSA | ? CoIP |
| ? RIP-qPCR | ? ChIP-qPCR | ? CUT&Tag |
相關(guān)資源
1、RNA pull-down的實(shí)驗(yàn)步驟
● 設(shè)計(jì)和合成RNA探針：根據(jù)目標(biāo)RNA序列的特定區(qū)域設(shè)計(jì)和合成RNA探針，通常使用化學(xué)修飾或放射性標(biāo)記來標(biāo)記RNA探針。
● 準(zhǔn)備RNA結(jié)合反應(yīng)體系：將RNA探針與細(xì)胞提取物、組織提取物或體外合成的蛋白質(zhì)混合，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的反應(yīng)體系。可以添加適當(dāng)?shù)木彌_液和輔助物質(zhì)來維持反應(yīng)條件和增加特異性。
● 進(jìn)行RNA pulldown：將RNA探針與固相材料（如瓊脂糖珠子或磁珠）結(jié)合，通過親和吸附的方式富集目標(biāo)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。可以使用離心管、微量管或固相提取柱等不同形式的富集材料。
● 洗滌和純化：對(duì)富集的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行洗滌，以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。可以使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液來實(shí)現(xiàn)選擇性的洗滌步驟。
● 蛋白質(zhì)鑒定和分析：對(duì)富集的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和分析，常用的方法包括質(zhì)譜分析（如質(zhì)譜鑒定或定量蛋白質(zhì)組學(xué)），Western blotting等。這些分析方法可以幫助鑒定和定量與目標(biāo)RNA相互作用的蛋白質(zhì)。
2、RNA pull-down應(yīng)用場(chǎng)景
● 鑒定RNA結(jié)合蛋白質(zhì)：用于篩選和鑒定與特定RNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，揭示RNA的結(jié)合伴侶和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
● 研究RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的功能：通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)估RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA穩(wěn)定性和翻譯調(diào)控等。
● 研究RNA修飾修飾酶：可以用于鑒定與特定RNA修飾酶相互作用的蛋白質(zhì)，了解RNA修飾的機(jī)制和調(diào)控。
● 探索RNA與疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用：通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，可以揭示RNA與疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用，并深入了解其在疾病發(fā)生和進(jìn)展中的作用。
3、研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的幾種常用技術(shù)簡(jiǎn)介、優(yōu)勢(shì)和適用范圍
| 技術(shù) |
簡(jiǎn)介 |
優(yōu)勢(shì) | 適用范圍 |
| RNA pull-down |
RNA pull-down技術(shù)用于研究RNA與與其相互作用的蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)利用RNA的特異性結(jié)合能力，通過將RNA靶點(diǎn)固定在固相支持上，然后與細(xì)胞提取物或純化的蛋白質(zhì)混合，通過共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。 |
- 可以直接檢測(cè)RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 | - 研究RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 |
| - 可以篩選和鑒定與特定RNA相互作用的蛋白質(zhì)。 | - 揭示RNA在基因調(diào)控和細(xì)胞功能中的作用。 | ||
| - 可以揭示RNA在基因調(diào)控和細(xì)胞功能中的作用。 | - 研究RNA參與的信號(hào)通路和疾病機(jī)制。 | ||
|
- 可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如質(zhì)譜分析和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，進(jìn)一步研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 |
|||
| CLIP-seq |
CLIP-seq技術(shù)（Cross-linking and immunoprecipitation followedby high-throughput sequencing）用于鑒定RNA與與其相互作用的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)結(jié)合了RNA與蛋白質(zhì)的共價(jià)交聯(lián)和免疫共沉淀，通過高通量測(cè)序分析交聯(lián)后的RNA和結(jié)合蛋白質(zhì)，鑒定它們的相互作用位點(diǎn)。 |
- 可以鑒定RNA與特定蛋白質(zhì)之間的結(jié)合位點(diǎn)。 | - 鑒定RNA與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用模式。 |
| - 可以全基因組范圍內(nèi)分析RNA-蛋白質(zhì)相互作用的模式和特征。 | - 揭示RNA參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和疾病機(jī)制。 | ||
| - 可以揭示RNA參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和疾病機(jī)制。 | - 研究RNA參與的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞功能。 | ||
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- 可以提供高分辨率的RNA-蛋白質(zhì)相互作用圖譜。 |
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| RNAi |
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種通過引入特定的小分子RNA（siRNA或shRNA）來抑制特定基因表達(dá)的技術(shù)。該技術(shù)可以靶向特定的RNA序列，并降低或抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。 |
- 可以高度特異性地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。 | - 研究基因功能和基因調(diào)控。 |
| - 可以進(jìn)行基因功能研究、基因沉默和表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)。 | - 高通量篩選和功能驗(yàn)證。 | ||
| - 可以在細(xì)胞和整個(gè)生物體中進(jìn)行基因敲除或敲下實(shí)驗(yàn)。 | - 研究信號(hào)傳導(dǎo)和疾病機(jī)制。 | ||
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- 可以研究基因調(diào)控、信號(hào)通路和疾病發(fā)生機(jī)制。 |
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| RIP |
RIP（RNA Immunoprecipitation）技術(shù)用于研究RNA與與其相互作用的蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)通過使用抗體特異性地免疫共沉淀RNA與其結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而鑒定和分析RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 |
- 可以鑒定RNA與特定蛋白質(zhì)之間的相互作用。 | - 研究RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 |
| - 可以研究RNA參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控和RNA穩(wěn)定性等過程。 | - 揭示RNA參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯調(diào)控過程。 | ||
| - 可以揭示RNA-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞功能和疾病發(fā)生中的作用。 | - 研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞功能和疾病發(fā)生中的作用。 | ||
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- 可以與高通量測(cè)序等技術(shù)相結(jié)合，獲得全基因組范圍內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)相互作用圖譜。 |
