熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（LCA）
- 高靈敏
- 低背景
- 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
- 非侵入性
服務(wù)特色
與其它蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)相比, 借助于煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(LCA)具有簡(jiǎn)單、靈敏、可靠、高效和低背景等優(yōu)點(diǎn), 并可輕松擴(kuò)展為大規(guī)模蛋白質(zhì)互作的篩選和驗(yàn)證研究。
服務(wù)介紹
熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（Luciferase Complementation Assay，LCA）用于判斷兩個(gè)蛋白是否能夠互作，將熒光素酶蛋白的兩個(gè)片段分別連接到兩個(gè)不同的待測(cè)蛋白上，若兩個(gè)蛋白能夠結(jié)合，則熒光素酶蛋白得以補(bǔ)全酶解底物發(fā)出熒光。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)
- 高靈敏度：LCA能夠檢測(cè)低至皮摩爾級(jí)別的蛋白質(zhì)互作，這使得它非常適合于研究低豐度蛋白質(zhì)的相互作用。
- 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：由于熒光素酶催化反應(yīng)迅速，且生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)，LCA能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)互作，無(wú)需固定或裂解細(xì)胞，從而減少了樣品處理過(guò)程中的損失和變異。
- 非侵入性檢測(cè)：LCA在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，允許在生理?xiàng)l件下觀察蛋白質(zhì)互作，提供更真實(shí)的生物學(xué)環(huán)境下的互作信息。
- 動(dòng)態(tài)范圍寬：LCA能夠覆蓋廣泛的互作強(qiáng)度，從弱到強(qiáng)的互作均可檢測(cè)。
客戶提供
由我司基因合成：
提供蛋白CDS序列即可。
客戶提供模板質(zhì)粒：
1、客戶提供載體/模板：需要提供載體mcs測(cè)序報(bào)告/模板測(cè)序結(jié)果，如無(wú)測(cè)序報(bào)告則需另外收取測(cè)序費(fèi)用，由金開瑞代為測(cè)序；
2、客戶提供菌液：菌液量應(yīng)≥0.5mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送樣；
3、客戶提供質(zhì)粒：質(zhì)粒量≥5ug；
4、菌液和液態(tài)質(zhì)粒均需冰袋運(yùn)輸。
最終交付
- 返還目的基因剩余質(zhì)粒；
- 默認(rèn)做3個(gè)陰性對(duì)照，1個(gè)實(shí)驗(yàn)組；
- 交付3片葉子照片；
- 結(jié)題報(bào)告以及全部原始數(shù)據(jù)。
服務(wù)說(shuō)明
| 服務(wù)名稱 |
服務(wù)內(nèi)容 |
交付內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn) | 服務(wù)周期（工作日） |
| 熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(LCA) |
質(zhì)粒提取 |
返還目的基因剩余質(zhì)粒 | 20 |
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注射煙草 |
默認(rèn)做3個(gè)陰性對(duì)照，1個(gè)實(shí)驗(yàn)組 | ||
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拍攝照片 |
交付3片葉子照片 |
案例展示
常見(jiàn)問(wèn)題與解析 (Q&A)
A：確保熒光素酶的兩個(gè)片段正確地融合到待測(cè)蛋白質(zhì)上，且表達(dá)載體沒(méi)有構(gòu)建錯(cuò)誤；提高細(xì)胞或生物體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化效率；增加細(xì)胞數(shù)量或生物材料量；確認(rèn)底物新鮮且濃度適當(dāng)。
A：減少非特異性結(jié)合，比如調(diào)整洗滌條件或使用適當(dāng)?shù)姆忾]試劑；確保細(xì)胞健康，避免細(xì)胞裂解導(dǎo)致的內(nèi)源性熒光素酶泄露；設(shè)立沒(méi)有預(yù)期互作的對(duì)照組，以確定背景水平。
A：標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作，確保每次實(shí)驗(yàn)的條件一致；引入內(nèi)參控制，如β-半乳糖苷酶或GFP，用于標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性；多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)估數(shù)據(jù)的一致性和可靠性。
A：通過(guò)Western Blotting等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；確保實(shí)驗(yàn)條件適合蛋白質(zhì)互作；考慮使用不同的蛋白質(zhì)片段或突變體。
相關(guān)技術(shù)服務(wù)
| ? 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) | ? 酵母雙雜交 | ? 酵母單雜交 | ? CoIP |
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| ? RIP-qPCR | ? ChIP-qPCR | ? RNA pulldown | ? 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC） |
| ? 植物亞細(xì)胞定位 | |||
相關(guān)資源
1、熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)為什么選擇煙草葉片作為實(shí)驗(yàn)材料？
● 易于轉(zhuǎn)化與表達(dá)：煙草植物（尤其是本氏煙草，Nicotiana benthamiana）是植物分子生物學(xué)研究中常用的模式植物之一，因?yàn)樗鼘?duì)于基因轉(zhuǎn)化具有很高的效率，特別是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。這使得LCA所需的重組熒光素酶片段可以在煙草葉片中快速、高效地表達(dá)。
● 葉片大且平展：煙草葉片較大且表面平展，適合進(jìn)行局部的注射或浸潤(rùn)處理，便于進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，同時(shí)也有利于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如生物發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)。
● 快速的生理響應(yīng)：煙草葉片在轉(zhuǎn)化后24-48小時(shí)內(nèi)即可觀察到熒光素酶的活性，這反映了蛋白質(zhì)的快速表達(dá)和互作，縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
● 低背景熒光：煙草葉片本身不含或含有極低水平的內(nèi)源熒光素酶活性，這降低了背景信號(hào)，提高了實(shí)驗(yàn)的信噪比，使得蛋白質(zhì)互作的檢測(cè)更加敏感和可靠。
● 適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)：煙草葉片的大面積和易操作性使其適合進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)互作篩選實(shí)驗(yàn)，尤其是在需要比較大量樣本的情況下。
● 成熟的技術(shù)體系：由于煙草葉片在植物遺傳轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)表達(dá)研究中的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)建立了成熟的技術(shù)體系，包括高效的基因遞送、蛋白質(zhì)表達(dá)和檢測(cè)方法，這為L(zhǎng)CA的實(shí)施提供了便利。
● 經(jīng)濟(jì)可行性：煙草植物易于培養(yǎng)和維護(hù)，與動(dòng)物細(xì)胞相比，其成本較低，適合長(zhǎng)期和大規(guī)模的研究項(xiàng)目
2、熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在多個(gè)研究領(lǐng)域中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價(jià)值，主要包括哪些？
● 蛋白質(zhì)互作研究：LCA能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的直接或間接相互作用，為理解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、復(fù)合體組裝及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)提供數(shù)據(jù)。
● 植物科學(xué)：LCA在植物激素響應(yīng)、抗逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域有所應(yīng)用，促進(jìn)作物改良和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
● 藥物發(fā)現(xiàn)與篩選：通過(guò)檢測(cè)特定蛋白質(zhì)互作的變化，LCA可應(yīng)用于高通量藥物篩選，加速新藥開發(fā)過(guò)程。
● 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析：LCA幫助揭示信號(hào)蛋白如何在細(xì)胞內(nèi)相互作用并傳遞信號(hào)，深入探究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制。
● 病原體-宿主互作：LCA在解析病原體感染機(jī)制、宿主防御反應(yīng)及免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，增進(jìn)對(duì)感染性疾病的理解。
● 遺傳疾病機(jī)制：通過(guò)研究疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的異常互作，LCA助力遺傳疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理研究。
● 腫瘤學(xué)：該技術(shù)用于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，為癌癥治療提供理論基礎(chǔ)。
3、熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)通常與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)聯(lián)用，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和全面性，或者從不同角度驗(yàn)證和補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以下是一些常見(jiàn)的與LCA聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：
● 免疫共沉淀（Co-IP）：Co-IP是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)互作檢測(cè)方法，通過(guò)抗體特異性地富集目標(biāo)蛋白及其結(jié)合伙伴，隨后通過(guò)SDS-PAGE和Western Blotting進(jìn)行分析。與LCA聯(lián)用可以驗(yàn)證蛋白質(zhì)互作的真實(shí)性，并提供互作蛋白的直接證據(jù)。
● 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：FRET技術(shù)通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)間的近距離相互作用。與LCA結(jié)合使用可以提供互作蛋白間距離的信息，進(jìn)一步確認(rèn)蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征。
● 質(zhì)譜分析（MS）：在LCA檢測(cè)到蛋白質(zhì)互作后，通過(guò)質(zhì)譜分析可以鑒定出互作蛋白的具體種類，提供蛋白質(zhì)組學(xué)層面的信息，有助于構(gòu)建詳細(xì)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。
● 酵母雙雜交（Y2H）：Y2H是一種在酵母細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的方法，特別適合于大規(guī)模篩選未知互作蛋白。與LCA聯(lián)用可以相互驗(yàn)證，特別是在高通量篩選后的驗(yàn)證階段。
● 細(xì)胞圖像分析：通過(guò)熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位和分布，與LCA聯(lián)用可以提供蛋白質(zhì)互作的空間信息，了解蛋白質(zhì)復(fù)合體的亞細(xì)胞定位。
● 基因沉默技術(shù)（siRNA/shRNA/Crispr-Cas9）：通過(guò)基因沉默技術(shù)降低特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可以研究該蛋白在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中的作用，與LCA結(jié)合使用可以進(jìn)一步探討蛋白質(zhì)互作的功能意義。
● ChIP-seq：針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究，Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) 可以確定轉(zhuǎn)錄因子在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，與LCA聯(lián)用可以深入理解轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的構(gòu)成和作用機(jī)制。
