RNA pull-down是研究細胞內RNA與蛋白/RNA結合情況的技術。先將RNA進行標記(如生物素標記),再與細胞裂解液共同孵育,從而形成RNA-RNA/蛋白質復合物,進而檢測與之結合的RNA或蛋白質。復合物洗脫后,通過熒光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量測序(RNA pull down-seq)方法來鑒定目標RNA是否與某些RNA分子相互作用,通過Western blot(pull down-WB)實驗和質譜(pull down-MS)技術檢測目標RNA是否與某些蛋白相互作用。

• 特異性：磁珠背景噪音低；無關 RNA 或突變 RNA 不會顯著影響特定 RBP 的富集。

• 超高靈敏度：可檢測低豐度RNA及弱相互作用蛋白，適用于珍貴樣本（如臨床活檢、單細胞樣本）。

RNA-蛋白質互作研究：

• 發(fā)現新型RNA結合蛋白：捕獲特定RNA（mRNA、lncRNA、circRNA等）的相互作用蛋白，揭示未知調控網絡。

• 驗證已知互作：精準檢測目標RNA與候選蛋白（如轉錄因子、酶）的物理結合，支撐機制研究

• 非編碼RNA功能解析和生物標志物挖掘

Q1: 實驗全程如何預防RNA降解？

實驗使用的所有試劑耗材需經過去RNA酶處理。

Q2：RNA pull-down?定要體外轉錄合成RNA探針嗎？

體外轉錄只是獲得RNA的?種?式，相比化學合成純度更高。所以pull-down實驗?般是體外轉錄得到目的RNA。當目的RNA序列大于2000bp時體外轉錄就不太容易轉錄成功，這時我們可以設計合成?小段目的RNA探針，通過探針與目的RNA結合，再與蛋白結合，便可繞過這個問題。

Q3：RNA在轉錄出來后，其OD?般都不高，可以使用嗎？如何定量呢？

OD值不高可進行RNA純化，即便不純化在實驗中多加?些RNA亦可。而定量問題?般會進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以根據marker濃度來判斷RNA的濃度。也可以用儀器測量RNA的濃度，但通過體外轉錄得到的RNA濃度都能達到2μg/uL以上。并且pull-down實驗不需要精確的定量，都會加入過量的探針。

Q4：關于樣本處理，細胞或者組織裂解時要不要加蛋白酶抑制劑或RNA酶抑制劑？還需要進行其他處理嗎？操作過程中需要注意什么？

細胞裂解需要加?蛋白酶和RNA酶抑制劑，最好能夠進行超聲處理。另外裂解蛋白的全程盡量在冰上操作。

Q5：lncRNA引物設計有什么注意事項？或者說與普通的引物設計有什么區(qū)別？

體外轉錄擴增的引物只需要在正向引物5’端加?T7啟動子序列即可。

Q6：質譜鑒定的蛋白主要是依據打分來進行篩選？這個篩選多少分算有效？

pull-down富集蛋白質譜分析后會剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，沒有明確的打分。需要排序的話?般是根據鑒定蛋白特征性肽段的數目作為參考。

Q7：做lncRNApull down+質譜?般都會發(fā)現多個互作蛋白對嗎？如何選擇哪一種蛋白繼續(xù)研究下去？

不同的RNA結合蛋白數量不等，根據實際鑒定的蛋白進行篩選；篩選的原則是根據自己研究的方向或相關功能確定這類蛋白。